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聚丙烯酰胺凝膠電泳作為檢測DNA序列差異的有效手段，變性凝膠電泳在我室廣泛使用，但是也有其使用范圍。在我室還有一種常用的非變性凝膠電泳技術(shù)，簡稱SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism，單鏈構(gòu)象多態(tài)性)。

原理：在SSCP測定中，雙鏈DNA(dsDNA)被變性成為單鏈DNA(ssDNA)，每一條單鏈DNA都基于它們的內(nèi)部序列而呈現(xiàn)出一種獨有的折疊構(gòu)象，即使同樣長度的DNA單鏈因其堿基順序不同、甚至單個堿基的不同會形成不同的構(gòu)象。這些單鏈DNA在非變性條件下，用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，單鏈DNA的遷移率和帶型，都取決于其折疊構(gòu)象和電泳時的溫度。

SSCP與變性凝膠電泳基本一致，不同之處有以下幾點：

a. SSCP使用非變性凝膠進(jìn)行電泳，即在凝膠配制中不加入變性劑。我室常用8%非變性膠(丙烯酰胺 80g，N- N，-亞甲雙丙烯酰胺 2.76 g，10×TBE 50ml，加水定容到1L)

b. 工作環(huán)境，由于SSCP受溫度影響，所以在電泳過程中應(yīng)防止溫度的升高，所以電泳環(huán)境為電壓400V，電流50mA，單板電泳功率為9W，不用預(yù)熱。緩沖液最好用新配制的。

c. 由于電泳功率較低，所以電泳時間較長，通常需要10小時以上，因此一般電泳需要過夜。室溫在25。C以下。

1. 聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜分離鑒定低分子量的蛋白質(zhì)，小于1kb的DNA片段和DNA序列。分析裝載的樣品容量大，可回收，DNA純度高。在催化劑TEMED(N-N-N，- N，-四甲基乙二胺)和過硫酸胺的作用下，丙烯酰胺聚合成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑，N- N，-亞甲雙丙烯酰胺的參與下，聚丙烯酰胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)結(jié)形成凝膠。

1.1 配制30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g

N- N，-亞甲雙丙烯酰胺 1g

加水至100ML，40C棕色瓶可保存二月

1.2 配制5×TBE緩沖液：

TRIS堿 54克

硼酸 27.5克

EDTA 3.72克

加水至1L

1.3 制備聚丙烯酰胺凝膠所用試劑體積

試劑制備不同濃度(%)凝膠所用試劑體積(ml)

3.55.08.012.020.0

30%丙烯酰胺11.616.626.640.066.6

水67.762.752.739.312.7

5×TBE20.020.020.020.020.0

10%過硫酸銨0.70.70.70.70.7

1.4 DNA在聚丙烯酰胺凝膠中有效分離范圍

丙烯酰胺(%)有效分離范圍(bp)二甲苯氰FF溴酚藍(lán)

3.51000-2000460100

5.080-50026065

8.060-40016045

12.040-2007020

15.025-1506015

20.06-1004512

2. 聚丙烯酰胺凝膠電泳具體步驟

2.1從NaOH池中撈出浸泡的玻璃板，取出上面的殘膠

2.2 把玻璃板拿到流動水處洗刷干凈

2.3 洗干凈的玻璃板至于玻璃板架上晾干

2.4 用乙醇擦洗玻璃板

2.5 帶凹口的背板涂上硅化劑，面板則涂上粘合劑，防止電泳完畢發(fā)生撕膠和脫膠的可能(涂摸要均勻)

2.6 面板在下，背板在上。兩側(cè)用塑料板密封，并用夾子夾好。底部調(diào)節(jié)使之水平

2.7 將加入催化劑后的凝膠沿凹口均勻倒下，插入適當(dāng)?shù)姆鈼l。勿使封條下留下氣泡。用夾子夾緊封條部位

2.8 室溫聚合30分鐘，小心取出凹口處封條，用水沖洗加樣孔(否則封條所殘留的丙烯酰胺在加樣孔聚合產(chǎn)生不規(guī)則表面，引起DNA帶變形)

2.9 將凝膠固定在電泳槽里。帶凹口背板朝里，面向緩沖液槽

2.10 用0. 5×TBE灌滿電泳槽的緩沖液槽，接上電極，打開電源。調(diào)試工作環(huán)境為電壓2000-2200V，電流150-200mA，單板電泳功率為80W。預(yù)熱30分鐘左右。

2.11 點樣之前需切斷電源，用槍將點樣孔的氣泡及膠吹出，然后插入點樣梳，注意不要插得太深，否則點樣膠面會變形，影響美觀及點樣。

2.12槍吸加樣品，PCR產(chǎn)物先加loading buffer 10ul ,再變性5分鐘左右，接著在冰水中冷卻5分鐘以上方可點樣，點樣完畢，電泳開始。

2.13 電泳至所需位置后，切斷電源，拔出導(dǎo)線，回收緩沖液，卸下玻璃板。在工作臺上，將背板撬起，放回原處。將面板進(jìn)行銀染

3. 電泳后的銀染檢測

3.1 原理：

影像產(chǎn)生是由于核酸在膠上所占部位與周圍的氧化——還原勢不同而產(chǎn)生。銀染液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，這樣核酸電泳帶就染成了黑褐色。

3.2 銀染

銀染液的配制：稱2.5至3.0g AgNO3加1200---1400ml水

銀染:將電泳完的面板首先在銀染漂洗盆了漂洗趕緊，使膠面上沒有異物。玻璃板反面沒有污染物。

將加入銀染液的銀染盆放在搖床上后，將面板放入銀染1小時左右。

3.3 顯影

顯影液的配制：NaOH---20g, Na2CO3----0.6g,甲醛4.5ml，加水1200ml

顯影：將面板從銀染盆里取出，在銀染漂洗盆里漂洗，震蕩5-6次，取出后使其表面盡量無水，再放入已加入顯影液的顯影盆里(顯影，顯影液的配制及甲醛的加入都需要在通風(fēng)櫥的搖床上進(jìn)行)顯影過程大約10到15分鐘，以DNA條帶清晰可見為準(zhǔn)。

將顯現(xiàn)完畢的板子在顯影漂洗盆里漂洗后，方可讀帶。

本實驗室凝膠電泳相關(guān)常用試劑配方：

1. 我實驗室常用的聚丙烯酰胺凝膠是6%變性聚丙烯酰胺凝膠(簡稱變性膠，PAGE)，就是在普通聚丙烯酰胺凝膠中加入變性劑。我們使用的變性劑是尿素。

6%PAGE具體配制方法為:

尿素210g，10×TBE 25ml ，丙烯酰胺28.5 g ，亞甲雙丙烯酰胺 1.5g，加水定容至500ml，過濾后使用。

考慮到方便使用的問題，一般一次配制2L(尿素840g，10×TBE100ml，丙烯酰胺114g，亞甲雙丙烯酰胺6g)。

2. 10×TBE(Tris-硼酸-EDTA)的配制

EDTA 7.44g，硼酸55g，Tris 108g，加水定容至1000ml

3. 10%過硫酸氨(AP)

10g過硫酸氨，純水定容至100ml

4. 硅化劑配方

二甲基二氯硅烷：無水乙醇=13ml：500ml

5. 反硅化劑(粘合劑)配制

無水乙醇 500ml(一瓶)，44ddH2O，3.3冰醋酸，550ul Bind silnce(3，-Trimethoxysilyl propyl)

配置完遮光4。C保存

6 loading buffer 配制

0.1g 二甲苯氰，0.1g 溴酚藍(lán)，1ml 0.5molEDTA ，100mL甲酰胺